呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是单股负链RNA病毒。它是引发毛细支气管炎等呼吸道感染的病原之一[1]。该病毒对婴幼儿的伤害尤其大[2],感染后极易发展为呼吸衰竭和重度肺炎[3],严重时会导致死亡。目前全球尚无统一有效的治疗方法或疫苗。西药利巴韦林是一种核苷类药物,可插入病毒的RNA基因链中导致基因错误突变,是一种广谱的抗病毒药[4]。已有研究证明利巴韦林对RSV感染有疗效[5,6]。它目前已被美国食品药品管理局批准以雾化形式用于治疗RSV感染[7],但是利巴韦林也被报道易导致并发症[8]和耐药性突变[9]。传统中药用于RSV感染的治疗在中国有着广泛的临床实践基础。《摄生众妙方》记载了中药定喘汤的配方,该药物可用于治疗咳嗽喘息。定喘汤可通过抑制病毒复制减少病毒对机体的伤害[10]。同时它也能修复RSV感染造成的机体天然免疫系统和获得性免疫系统的紊乱,提高机体自身免疫力以抵抗病毒[11]。此外定喘汤也可以通过下调小鼠TLR4和NF-κB mRNA的表达,减少因RSV感染引起的炎症反应[12]。

生物体内代谢物的变化能及时反映出机体正在发生的变化,而代谢组学是研究代谢物变化规律的科学,能系统地阐述机体代谢组的动态改变[13]。目前代谢组学已经被用于研究RSV感染后细胞[14]、尿液[15]、血液和组织[16]中的代谢物改变。研究人员通过核磁共振代谢组学方法,发现RSV感染婴儿的尿液中有13种代谢物与健康对照相比发生了显著性变化,包括1-甲基烟酰胺、4-脱氧苏糖酸、肌酸、2-氨基丁酸和琥珀酸等[15]。基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)平台对RSV肺炎小鼠模型的脂质代谢组学研究表明,小鼠肺组织和血浆中分别有多种脂质,包括磷脂、鞘脂、脂肪酸等发生代谢异常[16]。代谢物组学也被用于评价药物对RSV感染的治疗效果以及药物治疗机理研究[17,18]。基于LC-MS的代谢组学分析发现中成药金欣口服液可以改善RSV感染后血浆和肝组织中氨基酸代谢以及脂质代谢的紊乱[17]。基于气相色谱-串联质谱平台的研究发现中药黄芩中天然活性成分黄芩素能改善RSV感染小鼠的肝脏组织中天冬氨酸、甘氨酸和磷酸肌酐等相关代谢通路的失衡[18]。我们之前的研究也发现了定喘汤能有效改善RSV感染后多种胆汁酸异常,进而保护肝肠循环,维持肠道代谢稳定[19]。

本研究采用基于LC-MS的非靶向代谢组学方法[20],研究大鼠感染RSV后血浆代谢的改变及中药定喘汤对RSV感染大鼠的血液代谢异常的治疗效果,并通过研究定喘汤的3种分解剂,考察定喘汤的主要药效来源,以期能为RSV的药物治疗研究提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1大鼠、病毒和药品信息

SPF级Wistar幼龄大鼠(3周,辽宁本溪长生生物技术有限公司),呼吸道合胞病毒(RSV,中国预防医学科学院病毒所毒种室),中药组成和制备过程与我们之前发表的工作[21]一致。西药利巴韦林来自四川百利药业,用生理盐水制成10 mg/mL备用。所有中药材均来自辽宁中医药大学附属医院。定喘汤组由麻黄9 g、杏仁9 g、半夏9 g、苏子6 g、黄芩12 g、桑白皮9 g、白果9 g、款冬花9 g、甘草3 g组成;宣法分解剂由麻黄9 g、白果9 g组成;降法分解剂由杏仁9 g、半夏9 g、苏子6 g、款冬花9 g组成;清法分解剂由黄芩12 g、桑白皮9 g组成。将以上药物按照传统方法水煎2次混合后,制成含生药2 g/mL的药液备用。

1.1.2试剂

流动相和内标均为UPLC级别。其中,乙腈和甲醇来自Merck公司(达姆施塔特,德国),甲酸和内标均来自Sigma-Aldrich公司(密苏里州圣路易斯,美国)。将内标配制于甲醇中用于血浆代谢物的提取。内标的种类及含量如下:色氨酸-d5(L-tryptophan-d5, 4.26 μg/mL)、苯丙氨酸-d5(L-phenyl-d5-alanine, 3.61 μg/mL)、胆酸-d4(cholic acid-d4, 1.85 μg/mL)、鹅脱氧胆酸-d4(chenodeoxycholic acid -d4, 1.48 μg/mL)、棕榈酸-d3(palmitic acid-d3, 2.50 μg/mL)、硬脂酸-d3(stearic acid-d3, 2.50 μg/mL)、肉碱C2∶0-d3(carnitine C2∶0-d3, 0.16 μg/mL)、肉碱C10∶0(carnitine C10∶0-d3, 0.10 μg/mL)、肉碱C16∶0-d3(carnitine C16∶0-d3, 0.15 μg/mL)、胆碱-d4(choline-d4, 0.26 μg/mL)、溶血磷脂酰胆碱19∶0(lysophosphatidylcholine 19∶0, LPC 19∶0, 0.75 μg/mL)、磷脂酰胆碱38∶0(phosphatidylcholine 38∶0, PC 38∶0, 0.63 μg/mL)和鞘磷脂12∶0(sphingomyelin 12∶0, SM 12∶0, 0.13 μg/mL)。

1.1.3主要设备

全外排二级生物安全柜(SG403TXCE, Baker公司,桑福德,美国); 96孔除蛋白板(Phenomenex公司,托兰斯,美国); 96孔板正压装置(Waters公司,米尔福德,美国); Waters ACQUITY超高效液相色谱(Waters公司,米尔福德,美国)串联TripleTOF 5600质谱(AB SCIEX公司,弗雷明汉,美国)。

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