0 引言 Introduction

腰椎间盘退变是引起下腰痛的重要原因，是临床常见的慢性致残性疾病，严重影响人们的生活质量，增加社会经济负担[1-2]。椎间盘作为脊柱的重要组成部分，在椎体连接与脊柱运动中具有重要作用。椎间盘由三部分组成，包括外层纤维环、中央髓核及覆盖在纤维环和髓核上下的软骨终板[3]。在髓核组织中，髓核细胞分泌的蛋白聚糖和胶原蛋白是形成细胞外基质的主要成分，使得髓核组织呈现出高度水合的凝胶状[4]。髓核组织的病理改变是椎间盘退变的起始因素，并加速椎间盘退变进程[5]。椎间盘退变机制的研究虽尚不完全，但机械负荷、年龄、环境或遗传等因素引起的髓核细胞外基质的分解代谢异常、炎症因子的影响、髓核细胞早衰、增殖减缓以及髓核细胞过度凋亡在椎间盘退变中具有重要的作用。髓核细胞增殖和凋亡引起髓核细胞外基质代谢紊乱，针对髓核细胞增殖和凋亡的干预措施能够显著延缓椎间盘退变进程[6-7]。

microRNA(miRNA，miR)是一类非编码RNA，长度为21-25个核苷酸，与靶基因mRNA的3’非翻译区结合，从而介导靶基因mRNA降解、抑制翻译和mRNA不稳定[8-9]。越来越多的研究显示出miRNA与椎间盘退变密切相关，靶向miRNA可能具有延缓椎间盘退变的作用。相关研究表明，miR-221作用于细胞增殖与凋亡途径影响多种疾病的进展[10-11]。在椎间盘退变中抑制miR-221的表达，可显著减缓椎间盘退变程度[12]。椎间盘退变过程中髓核细胞增殖与凋亡的病理改变是影响椎间盘退变的重要因素，但miR-221是否通过作用于髓核细胞增殖与凋亡进而影响椎间盘退变进程尚待研究。

目前，中医药在延缓椎间盘退变的相关研究中已显示出明显疗效，中药能够通过增加髓核细胞外基质成分、降低椎间盘内炎症因子的表达以及抑制髓核细胞凋亡等方面发挥延缓椎间盘退变的作用[13-15]。此次研究中所用腰突颗粒为本课题组在临床中常用于治疗腰椎间盘突出症的经验方，前期研究显示，腰突颗粒具有延缓椎间盘退变的作用，但其对髓核细胞相关miRNA的作用尚不明确[16-17]。

此次实验通过采用miR-221模拟物及抑制剂转染大鼠髓核细胞，观察髓核细胞增殖与凋亡情况，并采用腰突颗粒进行干预，探究miR-221对髓核细胞增殖与凋亡的作用，以及腰突颗粒对退变髓核细胞中miR-221表达的影响，为今后研发新药以延缓椎间盘退变提供依据。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 于2018年6月至2019年8月在深圳市中医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 药材 实验所用药材均由深圳市中医院中药房提供。

1.3.2 细胞 大鼠髓核细胞由 Dr. G. Kollias’s Lab 赠送。

1.3.3 试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；CCK-8试剂盒(美国APExBIO公司)；microRNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂(日本Takara公司)；引物设计(上海生工公司)；microRNA转染试剂(上海吉凯公司)；miR-221模拟物、抑制剂(广州锐博公司)；Recombinant Rat TNF-α(美国Peprotech公司)；一步法凝胶制备试剂盒(杭州弗德公司)；细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司)；Bax、Bcl-2鼠单克隆抗体(北京博奥森)；HRP标记抗鼠IgG(上海康为世纪)；DAPI(上海索莱宝公司)。

1.3.4 仪器 真空冷冻干燥机(广州德祥公司)；旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；多功能酶标仪、垂直电泳仪、蛋白转膜仪、普通PCR仪、荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)；全自动化学发光仪(上海天能)；紫外分光光度计(美国Thermo)；荧光显微镜(德国蔡司公司)。

1.4 方法

1.4.1 腰突颗粒冻干粉制备 腰突颗粒冻干粉制备方法参考中药冻干粉相关文献并结合预实验对方法进行优化[18]。具体制备方法如下：腰突颗粒(独活20 g、桑寄生20 g、牛膝15 g、盐杜仲15 g、熟地黄15 g、黄芪20 g、茯苓15 g、川芎15 g、地龙15 g、当归10 g、白芍10 g、醋三棱10 g、醋莪术10 g、醋延胡索10 g、土鳖虫10 g、蜈蚣3条、甘草5 g)一剂，加入10倍体积的纯水进行微波提取30 min，过滤后将滤渣再加入10倍体积水，然后微波提取30 min，合并2次滤液，采用冷冻离心机进行离心，取上清，旋转蒸发仪减压浓缩，将浓缩液置于-80 ℃冰箱预冻24 h，然后放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，待干燥后将冻干粉用容器收集，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.4.2 细胞培养与分组 大鼠髓核细胞采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基传代培养。细胞融合至85%时胰酶消化细胞后离心重悬，调整细胞悬液浓度为5×107L-1，96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，24孔板中每孔加入1 mL细胞悬液，6 cm培养皿中每皿加入4 mL细胞悬液。实验共分为9组：①正常组：未经干预，只采用完全培养基培养的髓核细胞；②模拟物阴性对照组：加入20 nmol/L miR-221模拟物阴性对照处理的髓核细胞；③模拟物组：加入20 nmol/L miR-221模拟物处理的髓核细胞；④抑制剂阴性对照组：加入20 nmol/L miR-221抑制剂阴性对照处理的髓核细胞；⑤抑制剂组：加入20 nmol/L miR-221抑制剂处理的髓核细胞；⑥模型组：加入20 μg/L 肿瘤坏死因子α处理的髓核细胞；⑦腰突颗粒低浓度组：同时加入20 μg/L 肿瘤坏死因子α和100 mg/L腰突颗粒冻干粉处理的髓核细胞；⑧腰突颗粒高浓度组：同时加入20 μg/L 肿瘤坏死因子和200 mg/L腰突颗粒冻干粉处理的髓核细胞；⑨模拟物+腰突颗粒组：同时加入20 nmol/L miR-221模拟物和200 mg/L腰突颗粒冻干粉处理的髓核细胞。以上组中需转染细胞在转染后48 h对转染效率进行检测。

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